リアルタイムPCR
| 機種 | メーカー | 導入年 | 設置実験室 |
| 7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | H17 | 502機器分析室 |
利用者負担金対象
定期メンテナンス対象
絶対定量、相対定量、SNPsタイピング、＋/−アッセイが可能です。
※2012.4.6にソフトウェアのバージョンアップを行いました。
特徴
- 蛍光色素として FAM™, SYBR® Green 1, VIC®, TAMRA,™ ROX™,Cy3®,Cy5®, Texas Red® Dyeが使用可能
- 反応ボリューム10-100μlで測定
- 96ウェルプレートもしくは0.2mlチューブを使用
仕様
- 7500 Software v2.0.6
設備
- 簡易操作ガイド
- 参考資料
- 入門ガイド
・絶対定量
・相対定量
・SNPsタイピング
・＋/−アッセイ
・Standard Curve Experiments
・Relative Standard Curve and Comparative Ct Experiments
・Genotyping Experiments
・Presence/Absence Experiments
- Adhesive Seal Applicator (シールカバーをなぞってプレートに密着させるツール） １個
- Splash Free Support Base (チューブスタンド） １個
- インクジェットプリンター（EPSON, PX-V630)への出力可 ※有料
利用に関すること
- プレートやチューブを装置にセットするためのプレートホルダーには、プレート用とチューブ用があります。それぞれホルダーに明記してありますので、ご使用の際は、間違えないようご注意下さい。
| プレート用 | FOR USE WITH 96 WELL PLATES ONLY |
| チューブ用 | FOR USE WITH 8-STRIP & INDIVIDUAL TUBES ONLY |
- ＜注意！＞サンプルブロック汚染は、測定値に影響します。チューブの側面を汚染しないよう気をつけてください。
- Primer Express Software v3.0は現在のPCに対応していないので使えません。
[2012.6.26更新]
=================================================================
利用環境
PureDyeキャリブレーション
以下の色素のみキャリブレーションを実施しました。
・FAM
・SYBRGreen
・VIC
・TAMRA
上記以外の色素で測定される方は、キャリブレーションを実施致しますので、事前にスタッフにご連絡ください。
戻る
=================================================================
解析までのステップ
解析までの準備について、簡単にまとめました。
ステップ１：ケミストリの選択
| TaqManプローブアッセイ | SYBR Green I PCRアッセイ | |
|---|---|---|
| 原理 | レポーター色素及びクエンチャー分子で両端をラベルした配列特異的オリゴヌクレオチドプロープ（TaqManプローブ）を使用します。このTaqManプローブはPCR反応中フォーワードプライマーとリバースプライマー間のターゲット配列にアニールします。そしてそれに続く伸長反応でDNAポリメラーゼが5'エキソヌクレアーゼ活性によりTaqManプローブを分解していきます。その結果クエンチャー分子によりクエンチングされていたレポーター色素の蛍光強度が増加します。 | PCR反応によって増幅された二本鎖DNAへのSYBR Green I Dyeの取り込みによりDNAの定量を行ないます。SYBR Greenアッセイでは検出ターゲットに特異的な蛍光プローブは必要としませんが、非特異的な増幅産物を検出する可能性があります。 |
| 特徴 | 高い特異性 | 一次スクリーニング的な実験。非特異的産物が増幅しないPCRプライマーを使用することが前提。 |
ステップ２：ケミストリに合った試薬の準備
| TaqManプローブアッセイ | SYBR Green I PCRアッセイ | |
|---|---|---|
| 必要なもの | ターゲット遺伝子のPCRプライマー(Forword & Reverse)、ターゲット遺伝子のTaqMan Probe※、TaqMan Universal PCR Master Mix※2、サンプルcDNA | ターゲット遺伝子のPCRプライマー(Forword & Reverse)、PowerSYBR Green PCR Master Mix、サンプルcDNA |
※primerやprobeの検索は、Applied Biosystems社のHPからできます。
インターネットオーダーシステム
※2アプリケーションにより反応試薬が変わります。カタログなどでご確認下さい。
ステップ3:PCRプレートなどの準備
Real-Time PCRで使用できるプレートやキャップは、タイプが限られます。以下、Applied Biosystems製品（簡易操作ガイドより抜粋）。キャップは必ずFlatである必要があります。他社からも「Real Time PCR対応」として販売されているものがあります。
☆96-Wellプレートとキャップ
・MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate
・MicroAmp Optical Cap、8caps/strip(Flat)
・ABI PRISM Optical Adhesive Cover
☆チューブとキャップ
・0.2ml MicroAmp Optical Tubes
・0.2ml ABI Optical Tubes
・MicroAmp Optical Caps (Flat)
=================================================================
[2012.7.18更新]