アクティブボード・２０１３年　６月
　　　　　・・・・・２０１３年　６月　４日更新・・・・・

研究発表を行った学会；
・第６０回日本実験動物学会
　２０１３年　５月１５日〜１７日（つくば）

タイトル；マウス二細胞期胚の冷蔵保存技術を利用した遺伝子改変マウスの効率的な輸送法の開発.

発表者；堀越　裕佳　氏
　　　（熊本大学　生命資源研究・支援センター　資源開発分野）
Abstract；
【目的】低温科学技術の発達により、哺乳動物の生殖細胞の凍結保存あるいは冷蔵保存が可能となった。マウスにおいては、配偶子あるいは胚の凍結保存技術が確立されている。近年、冷蔵温度下において、生殖細胞を保存する技術の開発が進んでおり、遺伝子改変マウスの輸送における有用性が注目されている。生殖細胞の冷蔵保存が可能になれば、マウスの生体、凍結胚あるいは凍結精子の輸送に替わる新規輸送技術として利用できる。生殖細胞の冷蔵輸送は、特別な輸送装置や試料の取扱いに関する高度な技術を必要としないため、国内外の研究機関における遺伝子改変マウスの授受が容易になる。そこで我々は、マウス二細胞期胚を利用した遺伝子改変マウスの新規輸送システムの構築を目指し、マウス胚の冷蔵保存技術の開発を行った。
【方法】C57BL/6Jマウスから精子と卵子を採取し、体外受精を行った。体外受精により得られた二細胞期胚は、凍結保存し、融解後に冷蔵保存試験に使用した。各種冷蔵保存液（mWM、PB1、M2）中で胚を冷蔵保存し、冷蔵保存後の胚の生存率及び発生率を評価した。次に、冷蔵保存期間における各種保存液のpHを測定した。各種pH（6.8-8.0）に調整したM2培地を用いて、体外受精により作製した胚を用いて冷蔵保存し、生存率および発生率を評価した。さらに、当研究センターで作製した二細胞期胚を日本各地の研究機関に冷蔵輸送し、受け取り施設において胚移植を行い、冷蔵輸送された胚の産子への発生能を評価した。
【結果・考察】PB1およびM2において保存した胚は、120時間後も生存していた。冷蔵した二細胞期胚の発生能は、M2で保存した時のみ正常に維持された。本検討において、冷蔵保存培地のpHは、mWMにおいて顕著な上昇が認められた。M2のpHを調整することにより、冷蔵保存液のpHが冷蔵保存胚の発生能に及ぼす影響を調べた結果、pH7.2、7.3、7.4において発生能が維持された。本技術を用いて日本各地の研究機関に二細胞期胚を冷蔵輸送し、胚移植を行った結果、全ての施設において正常な産子が得られた。以上の結果から、二細胞期胚の冷蔵保存において、pHを7.2-7.4に調製したM2を使用することにより、胚の発生能を良好に保つことが可能であった。本知見は、マウス二細胞期胚の冷蔵保存に有用な基礎的情報を提供し、遺伝子改変マウスの新規輸送法として有用であることを示唆している。さらに、国際的に遺伝子改変マウスの生体輸送が制限されつつある現状を考慮すると、今後、二細胞期胚の冷蔵輸送技術が生体輸送に替わる手法として利用されることが期待できる。